短期穴位磁疗干预2型糖尿病肾病的作用及其分子机制探讨（世界中医杂志中文版，与英文扫描件）

翁建平^2,周子瑜#^1, 任丽伟#¹，杨含艳¹, 刘继章², 褚克丹¹, 于志文^1*

1. 福建中医药大学生物医药研发中心,福州 350122,中国;2. 中山大学第三附属医院内分泌科,广州510000,中国

摘要

目的：探讨穴位磁疗法是否能够延缓糖尿病肾病DKD的发展，并研究这一治疗作用的分子机制。方法:对28名2型糖尿病(T2D)患者在脾俞（BL 20）、足三里(ST 36)、肾俞(BL 23)和胰俞等穴位进行为期4周的脉冲磁疗干预，以病人尿微量白蛋白排出量、血浆丙二醛含量和脂多糖水平作为评价疗效的指标。结果：磁疗干预后,病人尿微量白蛋白排出量较干预前明显下降(27.21±3.51和8.51±0.95,P < 0.001)，血浆丙二醛明显降低(MDA,16.46±1.17 vs 12.40±1.86,P < 0.05)和脂多糖水平明显下降(LPS,37.41±3.84 vs 21.63±3.61,P < 0.05)，而其它代谢相关指标没有明显变化；磁疗法干预能够升高IκBα——炎症信号抑制蛋白含量(0.69±1.17 vs 1.30±0.29, P < 0.01)，并相应地降低炎症激活蛋白NF-κBp65(0.98±0.42 vs 0.43±0.28, P < 0.05)和NF-κBp50(1.19±0.40 vs 0.76±0.30, P < 0.05)的含量，磁疗法干预还能够抑制氧化酶Nox4(1.32±0.40 vs 0.37±0.23, P < 0.05)的表达。结论：短期磁疗干预T2D患者通过其潜在的抗氧化和抗炎作用延缓DKD发展。

关键词:穴位磁疗;糖尿病肾病;尿白蛋白;氧化应激;淋巴细胞

II型糖尿病(T2D)是一种全球流行疾病，且发病率逐年增加^[1]。T2D的严重后果之一是引起糖尿病肾病这一并发症，它导致了20-40%患病病人死亡^[2]。因此,预防和治疗糖尿病肾病(DKD)显得十分迫切。

研究表明，有多种病原学方面因素参与DKD的发病和进展^[3]。重中之重便是糖代谢异常，高血糖通过引起氧化应激损伤肾组织和功能^[4]。而氧化应激和炎症反应本质上是相关的，肾组织炎症反应是参与肾组织功能损害和病理性损伤的一个重要的病理生理学过程^[5]。过量的活性氧（ROS）能够导致氧化应激，活性氧通过激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶或者线粒体代谢^{[6, 7]}。基于这个原因，阻滞NADPH或线粒体ROS产生对于对抗氧化应激———包括DKD病程的发展十分重要。在ROS合成酶中，NADPH 氧化酶4(Nox4)备受关注，因为它在肾组织中高丰度表达^{[6, 8]}。进一步说，激活Nox4不但引起氧化应激而且导致炎症和凋亡反应最后造成肾损伤加重^{[6, 8]}。目前已有实验研究支持这一说法，有研究者观察到在DKD小鼠上高血糖能够上调Nox4蛋白表达，在肾细胞上给Nox4抑制剂或者进行Nox4基因沉默能够调节氧化还原以及肾损伤^{[9, 10]}。由于细胞在修复氧化还原平衡时具有清除ROS的防御机制，目前关于抗氧化酶体系和DKD之间关系的研究也有很多^{[5, 11, 12]}。Nrf2系统是机体主要的抗氧化系统，我们实验组和其他研究者均已发现在胰岛素抵抗和糖尿病状态时Nrf2系统功能受损，而这可能促使糖尿病综合征的发展^{[13, 14]}。证明这一发现的直接证据是以这一抗氧化系统作为药物靶点，激活后能够有效延缓DKD^{[10, 11]}。

近年来中医外治DKD方法多样，包括针灸疗法、穴位贴敷法、穴位注射、经穴埋线等^[15]，上述治疗方法在临床应用时均需考虑选取相应的穴位。取穴治疗ＤＫＤ是常用且有效的中医疗法之一。多个临床随机盲法实验报道证明，对早期DKD进行的以肾俞、脾俞、足三里、胰俞等为主要穴位的埋线或针灸治疗较之单纯西医疗法在改善DKD患者临床症状、降低尿微量白蛋白、改善肾功能或延缓肾功能恶化等方面具有更好的临床效果^[16-18]。在动物实验研究中，刘晓婷等发现，对DKD大鼠膈俞、脾俞、肾俞等背俞穴进行电针疗法，DKD大鼠的肾功能异常得到改善且肾脏病理损害在一定程度上减轻^[19]。此外，胰俞作为经外奇穴，在临床上对其进行针刺加以药物治疗手段，能较好地改善早、中期糖尿病患者脂肪代谢紊乱,具有降低和稳定血糖的作用，因而可从改善病人代谢，间接起到治疗DKD的作用^[20]。

现已证明磁疗在多种疾病中具有治疗作用^[21]。已有报道表明，在代谢性疾病及糖尿病相关疾病中，磁疗对脂肪肝、糖尿病引起的骨流失和神经性病变具有治疗作用^[22-24]。尽管磁疗的分子机制尚未完全了解，但它对抗氧化应激和调节免疫的作用已得到实验证明^{[25, 26]}，这两者皆和DKD发病过程密切相关^{[5, 11]}。我们因此认为，磁疗通过调节氧化还原平衡和炎性反应在延缓DKD发展中扮演了一个有利的角色。如果将其与穴位相结合，将会有助于提高疗效。

尿液中过多的尿白蛋白排出被认为是DKD发病的早期症状之一^[27]。降低尿微量白蛋白排出能够延缓DKD发展^[28]。为了检测磁疗是否对DKD具有治疗作用，T2D病人接受脉冲电磁场（PEMF）刺激干预，检测尿白蛋白排出。更进一步，我们还检测了一些与DKD发展相关的病原因素，包括代谢控制和血浆氧化还原状态。由于糖尿病与低度炎症相关^[29]，而脂多糖（LPS）作为炎症媒介与DKD发展相关，因此我们检测了血浆LPS含量。此外，为了研究磁疗潜在的分子机制，我们对病人血液淋巴细胞中调节氧化还原平衡和炎性信号的蛋白进行了检测。

材料与方法

1.临床资料

1.1一般资料

本研究的T2D患者均来源于2013年5月-2013年10月佛山市中医院内分泌科。此研究通过了福建中医药大学伦理委员会同意且参与研究的患者均知情同意。

本研究共28例患者，其中男性7例，年龄59～80岁，平均66.6岁；病程最短3年，最长22年，平均8.8年；女性21例，年龄48～82岁，平均68.3岁；病程最短2年，最长30年，平均10.6年。

病人的一般情况及血糖、胰岛素和尿蛋白测定见表1。

Table 1.General data of T2D patients (n=28)

1.2诊断标准

依据美国糖尿病协会制订的 2 型糖尿病的诊断标准^[30]: ①糖尿病症状 + 任意时间血浆葡萄糖水平 ≥ 11.1 mmol/L(200mg/dl); ②空腹血浆葡萄糖( FPG)水平 ≥ 7.0 mmol /L(126mg/dl); ③口服葡萄糖耐量试验( OGTT) 中， 2 h 血糖水平 ≥ 11 .1 mmol /L(200 mg /dl) 。糖化血红蛋白>6.5.

1.3纳入标准

①符合上述糖尿病诊断标准者；②愿意接受临床疗效观察且病人知情同意者。

1.4排除标准

①不符合上述诊断标准及纳入标准者；②排除1型糖尿病和由于其它急性感染、外伤、手术或明显应激情况引起的符合上述诊断标准的患者及妊娠期、哺乳期女性；③治疗期间改变原服用药物及服用抗氧化剂患者，及曾接受其他相关治疗有可能影响本研究疗效观察者；④未能按规定试验方案配合治疗，自行退出、无法随访、资料不全或其他原因无法观察疗效者。

2.磁疗仪器

采用可用于人体的PEMF治疗仪(YX-200磁疗仪，专利号No.CN200610036313.8,佛山玉玄宫,中国)磁疗仪主要包括PEMF发射器，漆包线构成的线圈软磁导磁材料，线圈和导磁材料置于绝缘外壳中组成治疗头（图1）。发射器发射独立、单个、方形脉冲波，频率为1HZ，波持续时间为25ms±2ms。

3.取穴及操作方法

取脾俞（BL 20）、足三里(ST 36)、肾俞(BL 23)和胰俞等穴位[16]，将磁疗头放于相应穴位上，以1.2T ± 120mT的磁场强度，每个穴位10分钟，每日两次，持续治疗4周。

在磁疗干预期间，患者继续保持原有药物治疗。

Table 2. TheMedication of T2D patients (n=28)

4.指标检测

采用病例自身前后对照法评估穴位磁疗干预的治疗作用。

4.1 疗效指标检测

尿微量白蛋白（U-mAlb）分析

收集夜尿于同一清洁容器中，用Quik Read U-mAlb酶联免疫(ELISA)试剂盒（Orion DiagnosticaOy, Espoo, 芬兰）依照说明书分析U-mAlb含量。大于20mg/L 视为不正常。

代谢评估

按报道方法采集病人磁疗干预前后空腹血液^[31]。血糖(FBG)、胰岛素(INS)、C肽(C-P)、甘油三酯(TG),总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)等在临床检验室分析检测。

4.2 机制指标检测

通过丙二醛（MDA）含量检测，观察机体的氧化应激水平；通过蛋白免疫印迹技术（Westen Blot）检测相应的炎症信号蛋白，如IκBα、NF-κB p65和NF-κB p50等，氧化酶Nox4及Nrf2抗氧化系统信号蛋白等。

丙二醛（MDA）测定

用MDA试剂盒(南京建成公司，南京，中国)测定血浆MDA含量，操作遵循说明书进行。

LPS 分析

用LPS ELISA试剂盒(CUSABIO，武汉，中国)测定血浆LPS含量，操作遵循说明书进行。

淋巴细胞分离和蛋白免疫印迹分析

采用血淋巴细胞提取试剂盒(上海科华生物工程，上海，中国)通过密度离心分离提取淋巴细胞。依据报道方法进行淋巴细胞蛋白制样和蛋白免疫印迹分析[32]。抗体NF-κB p65，NF-κBp50,Nox4,Nrf2和GAPDH购自Santa Cruz (上海,中国)。抗体IκBα, SOD1和SOD2购自Proteintech (广州,中国)。抗体HO-1,NQO-1,Bax和Bcl-2购自Cell Signaling (广州,中国)。抗体caspase-3,caspase-8购自Sangon Biotech (上海,中国)。

5. 统计方法

所有数据都表示为平均值±标准误差(SEM)。采用paired-sample T Test或方差分析, p< 0.05被认为具有统计学意义。

结果

1、 穴位磁疗能有效降低T2D病人尿白蛋白排出，但不改变病人血糖水平。

如图2所示磁疗干预前病人U-mAlb含量为27.21±3.51 mg/L,而经过四周的磁疗干预后的U-mAlb大幅减少到8.50±0.95 mg/L(约减少70%,n = 28,p< 0.001)。为了评估磁疗是否能改变肾脏功能,我们检测了血液中肌酐含量并计算肌酐清除率这一肾功能指标,发现并没有改变。

为了确定病人的代谢功能是否改变以及它与磁疗延缓DKD的相关性,我们检测了患者的代谢功能指标。如表2所示病人在磁疗干预后FBG和血脂包括TG,TC均未改变，仅血LDL-C含量下降。

Table 3. Effects of Acumagnetotherapy on blood glucose and lipid levels (n=28)

2、 穴位磁疗调节T2D病人血淋巴细胞中氧化还原平衡，并抑制ROS合成酶表达。

我们测量病人血浆MDA水平以反映其氧化还原状态。观察到磁疗干预后患者血浆MDA水平降低(约减少30%,前:16.46±1.17 vs后:12.40±1.86,n = 6,p< 0.05,图3)。增加ROS产生或清除能力能够影响氧化还原平衡。为进一步探索磁疗抗氧化作用的潜在机制,我们提取患者血淋巴细胞，用蛋白免疫印迹法检测ROS合成酶Nox4和Nrf2抗氧化系统蛋白表达情况。我们观察到在磁疗干预后Nox4蛋白含量明显降低(前:1.32±0.16 vs后:0.38±0.09,n = 6,p< 0.05,图3 b)，而Nrf2抗氧化系统（包括NQO-1，HO-1）并未同时改变(图3 c和D)。

3 、穴位磁疗减少T2D病人血LPS水平，抑制血液淋巴细胞中炎症信号。

关于磁疗是否能够影响炎症系统，我们检测了血浆LPS水平这一炎症指标，并观察到磁疗干预能够降低炎症水平(约减少45%,前:37.41±3.84 vs后:21.63±3.61,n = 6, p< 0.05,图4)。为检测磁疗对炎症的潜在信号机制,我们检测了NF-κB抑制蛋白——IκBα的含量,发现在淋巴细胞中磁疗明显增加其蛋白含量表达（前:0.69±0.14 vs后:1.30±0.12,n = 6,p< 0.01,图4 b和C)。此外,NF-κB的两个亚结构, NF-κB p65和NF-κBp50，在磁疗干预后含量减少 (图4 b和C)。

4 、穴位磁疗抑制T2D病人血淋巴细胞凋亡蛋白信号表达。

氧化应激和炎症可以引起细胞损伤和凋亡,这密切参与DKD病程的发展。外源性和内源性凋亡刺激均可激活凋亡蛋白caspase-8和3的表达。为了评估细胞凋亡过程能否被磁疗干预改变,我们检测了caspase-3和caspase-8的蛋白水平，并发现磁疗干预后蛋白表达减少(图5 A和B)。而与此相应的，促凋亡蛋白Bax被显著抑制约50%(前:0.24±0.02 vs后:1.30±0.01,p< 0.05,图5 A和B)，然而抗凋亡蛋白Bcl-2含量并未改变。

讨论

中医对早期DKD辩证认为脾肾亏虚，瘀阻肾络是该病病机关键，治则当以健脾益肾为基本大法。本研究所选肾俞、脾俞、胰俞均为脏腑经气输注于腰背部的背俞穴，是内脏器官生理、病理状态在体表机能的感应点。肾俞具有滋阴补肾、培补元气作用；脾俞、足三里健脾益气；胰俞是治疗糖尿病的特定奇穴。诸穴合用，具有健脾益肾、益气养阴之功效，为早期DKD的主要治疗穴位^{[16, 17]}。本研究主要发现在脾俞、足三里、肾俞、胰俞等穴位进行为期四周的PEMF磁疗干预能够显著降低T2D病人U-mAlb排泄，同时显著减少患者血浆MDA和LPS水平。因此，从磁疗方法角度深化了对针灸穴位治疗DKD机理的认识。

由于良好的代谢控制有利于预防和延缓包括DKD在内的糖尿病并发症进程^{[3, 33]}，而短期磁疗不影响代谢控制，说明磁疗干预延缓DKD发展的有利作用可能独立于对机体代谢控制，而与它的抗氧化和抗炎功效有关。想直接获得磁疗对DKD的作用的信号机制,最好的办法是进行肾活检。然而这个理想的实验方法由于对患者肾组织存在一定的侵入损伤性，不易被患者接受。因此,我们退而求其次选择提取患者血淋巴细胞这一简单可行的方法来研究磁疗的分子信号基础。我们在血淋巴细胞的结果表明磁疗干预调节氧化还原平衡主要通过抑制ROS产生而非加强抗氧化系统能力，因为ROS合成酶Nox4蛋白表达明显降低，而与此同时Nrf2抗氧化系统没有明显激活。在过去的报道中已表明了Nox4参与DKD进展的重要性^{[6, 10]}。Nox4作为主要的ROS合成酶能够导致初期DKD的一些病理性病变^[6]。更重要的是,目前已在体内和体外实验中证明使用Nox4抑制剂或进行Nox4基因沉默能够阻止DKD的发展^{[9, 10]}。我们的结果显示磁疗在淋巴细胞对Nox4蛋白的抑制效果明显，这提出一种可能性,即在患者的肾组织中，磁疗干预可能存在类似的分子机制通过抑制肾组织氧化应激以对机体有利。当然在肾组织中的这种情况仍需要进行进一步的研究。

由于氧化应激与炎症激活导致的肾细胞凋亡和蛋白尿等功能变异密切相关^{[11, 28]}，所以我们非常有兴趣观察磁疗对细胞炎症信号和凋亡过程的改变。我们观察到PEMF治疗后病人淋巴细胞中炎症和凋亡信号蛋白均受抑制(图3和4)，与此同时, 患者血浆LPS水平显著减少(约45%)^{[29, 34]}。血中LPS是炎症激活的一个重要媒介，它通过与位于细胞表面的Toll样受体结合激发炎症过程,那么减少血液LPS水平可衰减炎症反应，进一步改善肾损害。而我们的数据表明,磁疗干预可以保护T2D患者抵抗氧化应激和炎症引起的损伤和细胞凋亡。目前,很难进一步说明PEMF如何影响氧化还原平衡和炎症过程，由于磁疗对信号通路的整体机制还尚未清楚^[21]。几项研究表明磁疗能够调节细胞脂质双分子层和离子通道极性^{[21, 35]}。膜极性变更后能影响位于膜脂质载体上蛋白和作为第二信使调节离子通量的信号蛋白的交互作用，进而调节信号转导^{[21, 35]}。当然磁疗调控的膜极性和离子极性与我们研究中的分子和信号改变是否有因果联系，仍需要进一步的研究探索。

作为一种非侵入性和相对安全的替代方法,磁疗法在临床上已经被用于治疗多种疾病, FDA已证明其能够治疗抑郁症^[36]。我们的数据显示它与穴位结合能够显著减少糖尿病患者U-mAlb排泄以预防DKD进程，这提高了其临床应用价值。此外,由于氧化应激和炎症都是糖尿病并发症发展的病因学因素,磁疗可能在其他糖尿病并发症上有更广泛的治疗意义。        总之,目前我们研究表明,短期穴位磁疗能够减少T2D患者尿白蛋白排出,机理可能通过降低LPS水平下调炎症信号以抵抗氧化应激，这为其在预防DKD的临床应用上提出依据。

感谢该工作部分由于志文教授的中国自然科学基金支持 (编号：81270886)。我们感谢李盺和陈礼仪帮助提取淋巴细胞。利益冲突作者宣称关于出版没有利益冲突。